Tömegspektrométer alapú proteomikai Labor

Tömegspektrométer alapú finomanalitikai labort hoztunk létre. A laborban 2 kiemelt projektet indítottunk. Egyfelől tömegspektrométeres alapú proteomikával foglalkozik ez a kutatócsoport, másfelől korábbi K+F+I projektjeink (RET, JEDLIK) követő projektjeként tömegspetrométerrel összekötött sebészi eszközt állítottunk be humán műtőbe és általában fejlesztjük az in vivo imaging technikák tömegspektrométerrel való összekapcsolását. (emésztő rendszeri endoszkópos vizsgálatok, szívkatéteres vizsgálatok)

A tömegspektrometriás proteomikai/metabolomikai bázislabor tevékenysége alapvetően az újfajta „–omikai” azaz rendszerbiológiai jellegű megközelítések kifejlesztésére, valamint ezek gyakorlati alkalmazhatóságának felmérésére irányult. A kutatás első szakaszában a korábbi NKTH/NIH által támogatott projektek megvalósítása során kifejlesztett tömegspektrometriás technikákat alkalmaztuk gyakorlati szövettani, illetve mikrobiológiai diagnosztikai problémák megoldására.

A munka első szakaszában a csoportunk által korábban kifejlesztett deszorpciós elektrospray ionizációt (DESI) alkalmaztuk szövetek kémiai képalkotására. A DESI eljárás során fagyasztott szövettani metszeteket vizsgáltunk olyan módon, hogy a minta felületének minden 100 µm X 100 µm-es pixeléről készült egy DESI tömegspektrum. Az ilyen módon létrejött adattömeg alkalmas egyes szöveti komponensek – natív biomolekuláris komponensek vagy gyógyszermolekulák – térbeli koncentráció eloszlásának meghatározására. Vizsgálataink során azonban túlléptünk ezen a hagyományos megközelítésen, és azt vizsgáltuk, hogy a teljes tömegspektrometriás információ (ti. a pixelenkénti nagy felbontású tömegspektrum) alkalmas-e a szövet szövettani besorolásának megállapítására, illetve amennyiben ez sikeres, milyen további információ nyerhető a spektroszkópiai adatokból.

A vizsgálatokat az egyetem II.sz. Patológiai Intézetével együttműködésben hajtottuk végre. A vizsgálatok tárgya elsősorban colon adenocarcinoma, illetve ennek a tumortípusnak a máj metastasisai voltak. A colon adenocarcinomára azért esett a választás, mert ebből a tumortípusból viszonylag nagyszámú minta állt/áll rendelkezésre. Az elemzés előtt a mintáról autofluorszcens fotó, illetve szomszédos metszetből hematoxilin-eozinos festés készül. A tömegspektrometriás kép egyes részeit ez utóbbi alapján azonosítjuk be, azaz rendelünk hozzá valamilyen szövetttani típust. Az adatok kiértékelésére kétféle stratégiát dolgoztunk ki. Egyrészt a szövettanilag specifikus spektrumok alapján próbálunk egyértelműen az adott szövettípusra jellemző biomarkert találni. Másrészt pedig a spektrális mintázat alapján is megkíséreljük a szövettípusok azonosítását. Ebben az esetben a teljes spektrális információt egy adatvektorként kezeljük amely az alkalmazott tömegtartománytól és tömegspktrometriás felbontástól függően 300 usque 20000 dimenziós. Az adatelemzés első lépése a dimenziószám csökkentése főkomponens analízis segítségével. A dimenziószámot tipikusan 60-ra csökkentjük. A dimenziócsökkentést követően kiválasztunk olyan képpontokat, amelyek egyértelműen besorolhatóak valamely szövettípusba, majd ezen adatpontok segítségével egy olyan, szintén 60 dimenziós, de immár nem ortogonális teret hozunk létre, amelyben az ismert szövettípusok maximálisan elkülönülnek. Ezt követően az összes adatpontot klasszifikáljuk, azaz besoroljuk valamely szövettani kategóriába. Az adatfeldolgozás eredményét szövettípus függő színkódokkal vagyunk képesek vizualizálni. Bár a módszer egyelőre csak korlátozott számú szövettípus azonosítására alkalmazható, ettől függetlenül egy felhasználó-független, objektív azonosítást tehet-tesz lehetővé. A projekt későbbi fázisában vizsgáltuk a szöveti KRAS mutáció és a tömegspektrometriás adatok közötti összefüggést. A KRAS mutáció jelenléte és lokalizációja a fehérjét kódoló génen belül fontos prediktív markerként szolgál gasztrointesztinális adenocarcinomák esetében. A mutáció jelenlétéből következtetni lehet a tumor egyes kemoterapeutikumokkal szembeni érzékenységére, valamint metasztázis képzési hajlamára. A KRAS mutáció jelenléte jelenleg kizárólag molekuláris genetikai módszerekkel igazolható, amelyek idő és költségigényesek. A tömegspketrometriás alapú KRAS diagnosztika fajlagos költsége alacsony, és lényegében azonnali eredményekkel szolgálhat. A vizsgálatok eredményeképpen sikerült azonosítani a KRAS mutáció jelenlétére utaló spektrális mintázatot, melynek alapján nem csak a mutáns ill. vad típusú gént hordozó tumortípusok különíthetőek el, hanem a mutáció helye (12-es vs. 13-as kodon) is meghatározható. Érdekes módon a KRAS fehérjével közvetlen módon kapcsolatba hozható ionok nem figyelhetőek meg a tömegspektrumokban, azonban a nagy intenzitással jelen levő komplex lipid-eredetű ionok eloszlásából egyértelműen lehet következtetni a fenti információkra. A KRAS nem vesz részt közvetlenül a komplex lipidek szintézisében, viszont regulációs szerepe van ezen enzimek működése tekintetében.

A munkánk második szakaszában a képalkotó kísérletek során tapasztalt nagy fokú szövettani specificitást kíséreltük meg felhasználni műtét közbeni tömegspektrometriás szövetvizsgálati alkalmazások során. Az in-vivo tömegspektrometriás projekt célja olyan tömegspektrometriás ionizációs technikák kifejlesztése, amelyek alkalmasak élő szövetek közvetlen vizsgálatára. Jelen munkaszakasz során komoly előrelépést tettünk a módszer érzékenységének javítása területén. A korábban alkalmazott REIMS (Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry) technika a szövetek monopoláris elektrosebészeti elpárologtatásán alapult, ami ugyan lehetővé tette a szövetek műtéti beavatkozás során történő in-situ vizsgálatát, viszont komoly korlátokat jelentett a viszonylag nagy mintaigény. Egy jó minőségű spektrumhoz mintegy 0,05 usque 5 mg élő szövet elpárologtatása szükséges, ami egyrészt sebészetileg nem indokolható, másrészt pedig általában nem teszi lehetővé a szövettanilag homogén mintavételt. Jelen munkaszakasz során a korábbi monopoláris elektrosebészeti módszer mellett sikeresen megvalósítottuk a bipoláris elektrosebészeti technika tömegspektrometriával történő kombinációját. A fejlesztés eredményeként létrejött technika használata során a bipoláris csipesszel elpárologtatott szövetből keletkezett aeroszolt közvetlenül vezetjük a tömegspektrométer atmoszferikus interfészébe. A technika ilyen módon mintegy 2-3 nagyságrenddel érzékenyebbé válik, és lehetővé teszi kevesebb, mint egy mikrogramm szövet vizsgálatát, illetve valós idejű azonosítását. A technika elsősorban idegsebészeti környezetben alkalmazható, ezért a kipróbálását a fentebb említett, agysebészeti beavatkozások során nyert ex-vivo tumorminták elemzésével teszteltük. A sikeres tesztelést követően az eszközt alkalmassá tettük a humán idegsebészeti környezetben történő használatra és sikeresen ki is próbáltuk a Debreceni Egyetem Idegsebészeti Intézetében, Prof. Bognár Lászlóval együttműködésben. Az eszközt jelenleg heti mintegy 4-5 műtéti beavatkozás során alkalmazzák, azonban egyelőre csak adatgyűjtési célból.

A bipoláris technika lehetővé teszi – az idegsebészeti alkalmazások mellett – a biopsziás minták vizsgálatát is. Tekintettel a tumorbiopsziás minták addicionális vizsgálata (ti. a hisztológiai elemzésen túlmutató) során felmerülő etikai problémákra, a módszert anyagcserebetegség iránydiagnózisú betegek májbiopsziás mintáin teszteljük. A munkaszakasz során eddig mintegy 42 db bioptátumot vizsgáltunk bipoláris REIMS módszerrel. Az eddigi eredmények alapján a tömegspektrometriás információ jól korrelál a szövettani vizsgálatok során nyert diagnózissal.

Az elmúlt munkaszakaszok során számos kísérletet végeztünk annak feltárására, hogy az ultrahangos (vagy agyműtétek esetében gyakran ultrahang nélküli) szívó berendezések által létrehozott szöveti homogenizátum milyen módon ionizálható, azaz a két technika (ti. sebészeti és tömegspektrometriás) hogyan kapcsolható. A kísérletek során fény derült arra, hogy amennyiben a fent említett szöveti homogenizátumot egy Venturi-elven működő légsugár szivattyúval távolítjuk el a műtéti területről, a szivattyú nem csupán elszívja a homogenizátumot, hanem pneumatikusan el is porlasztja azt. Tekintettel arra, hogy a Venturi szivattyú nem tartalmaz sem mozgó alkatrészt, sem pedig 1 mm-nél kisebb belső átmérőjű kapillárisokat, az eszköz képes hosszabb időn keresztül (>1h) a meghibásodás (eltömődés) komolyabb esélye nélkül működni. A szivattyú által elporlasztott szöveti homogenizátum megfelelő frakciója atmoszferikus ionizációs tömegspektrométerrel közvetlenül vizsgálható. Bár a méret illetve töltés szerinti frakcionálás elhagyása a tömegspektrometriás analizátor idő előtti elszennyeződését vonja maga után, ezt a problémát sikeresen áthidaltuk az elmúlt munkaszakasz folyamán. A létrejött módszert sikeresen teszteltük laboratóriumi környezetben, és jelenleg a klinikai tesztelés van folyamatban.